外显子测序

外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和,该区域包含着合成蛋白质所需要的信息,涵盖了与个体表型相关的大部分的功能性变异。相对于全基因组测序,在同样的测序通量下,外显子组测序的覆盖度更深,数据准确性更高。因此外显子测序对于发生在外显子区的常见和罕见变异具有很高的检测灵敏度,其具有简便、经济、高效等特点。

测序平台:HiSeq 4000 PE250 

项目周期:45个工作日 

推荐测序深度:≥100X


样品要求

gDNA≥2ug;
浓度≥20ng/ul;
条带完整,无降解,无杂质污染


研究领域

  1. 辅助检出肿瘤:快速经济地从肿瘤异质检出低占比的亚克隆;
  2. 遗传病研究:筛选疾病相关候选位点或区域;
  3. CNV的研究:为拷贝数变化的检测提供有效的方法。

技术路线


技术流程


个性化分析图表展示


案例解析

【案例一】

基于全外显子测序鉴定的LDLR和APOA5的稀有等位基因位点使得患心肌梗死的风险提高

研究背景:

心肌梗死(MI)是全球范围内导致人死亡的一个重要疾病,其遗传模式通常较为复杂,早发型心肌梗死往往是由于基因遗传导致的。曾有关于低密度脂蛋白基因的稀有突变增加患心肌梗死的风险的报道,而有超过45个基因座位上的突变与增加心肌梗死的患病风险有关。本研究通过对非MI组(健康个体)及早发型心肌梗死组(9793个早发型心肌梗死患者)进行外显子测序分析,评估了人群中稀有突变对早发型心肌梗死的影响。早发型心肌梗死患者的编码区上的2个稀有突变的频率与非MI组有显著差异,低密度脂蛋白(LDLR)受体上携带稀有非同义突变使患心肌梗死的风险增加4.2倍,LDLR携带无义等位基因使患心肌梗死的风险增加13倍,大约2%的早发型心肌梗死病患在LDLR位点携带稀有突变,这与四十年前通过总胆固醇进行分析的结果一致。在对照组中,大约217个人中有一个的LDLR编码区产生突变,且 含量>190mg dl-1,载脂蛋白A-V(APOA5)上携带稀有非同义突变患心肌梗死的风险增加2.2倍。LDLR突变携带者比没携带者的等离子低密度脂蛋白胆固醇水平更高,而APOA5突变携带者比无携带者的等离子甘油三酯水平更高。最近的研究表明心肌梗死患病编码序列突变与两个APOA5相关功能基因相关,分别为脂蛋白脂肪酶和载脂蛋白C-III。综合上述分析,与血浆LDL胆固醇含量一样,富含三酰甘油的脂蛋白代谢紊乱会增加患心肌梗死的风险。

方法流程:

研究结果:

通过1973个患早发型心肌梗死的个体进行人全外显子测序数据(图5-1),结合单核苷酸芯片和数据统计计算低频变异对心肌梗死的患病风险影响。此外,还进行重测序及外显子测序分析与心肌梗死的相关的稀有突变。 通过对6721个心肌梗死患者和6711个对照组进行APOA5外显子测序(图5-2),发现46个非同义突变或剪切位点变异的SNV或移码InDel突变,频率低于1%。经分析携带APOA5稀有突变的个体比无携带该突变的个体患心肌梗死或环状动脉病的风险增加2.2倍。

对4703个心肌梗死患者和5090个非心肌梗死患者进行测序挖掘低密度脂蛋白受体中的破坏性突变(最小等位基因频率低于1%的无义突变、indel移码突变、剪切位点突变),发现非MI组携带率为0.04%,早发型MI患者携带率为0.51%,是非MI组的13倍(图5-3)。 对不同的低密度脂蛋白受体的基因突变进行功能分类(图5-4),发现其突变对应的低密度脂蛋白胆固醇水平具有显著差异。其中携带破坏性突变(279mg dl-1)和没有携带任何非同义突变(135mg dl-1)的个体具有最显著的差异。

【案例二】

外显子测序分析在阳光暴露下黑色素瘤中的NF1的频发突变和RASopathy基因

研究背景::

本研究主要针对213个黑色素瘤患者进行全外显子(WES)测序,我们分析鉴定了NF1(RAS的负调控因子),是作为黑色素瘤中继BRAF和NRAS后的第三个高频突变基因。 NF1突变在表达野生型BRAF和RAS的46%的黑素瘤中是失活的,这种失活发生在老年患者中,并且显示与其他RAS病变基因,特别是RASA2的突变模式的不同。功能研究表明NF1抑制能够导致大多数病例中RAS活性增加,但不是在所有的黑色素瘤病例都有这种作用。此外,MEK或ERK抑制剂对NF1缺失并不敏感,研究细胞中MEK磷酸化诱导后NF1突变体的敏感型和抗药性的反馈通路,有助于相关药物的研究。本研究得出以下的结论:在黑色素瘤中NF1缺失型是一个关键的肿瘤抑制因子,且并发RASopathy基因突变可能能增强NF1的作用。

方法流程:

研究结果:

本研究主要针对213个黑色素瘤患者进行全外显子(WES)测序,我们分析鉴定了NF1(RAS的负调控因子),是作为黑色素瘤中继BRAF和NRAS后的第三个高频突变基因。 NF1突变在表达野生型BRAF和RAS的46%的黑素瘤中是失活的,这种失活发生在老年患者中,并且显示与其他RAS病变基因,特别是RASA2的突变模式的不同。功能研究表明NF1抑制能够导致大多数病例中RAS活性增加,但不是在所有的黑色素瘤病例都有这种作用。此外,MEK或ERK抑制剂对NF1缺失并不敏感,研究细胞中MEK磷酸化诱导后NF1突变体的敏感型和抗药性的反馈通路,有助于相关药物的研究。本研究得出以下的结论:在黑色素瘤中NF1缺失型是一个关键的肿瘤抑制因子,且并发RASopathy基因突变可能能增强NF1的作用。

60%的NF1突变体黑色素细胞系对MEK抑制剂敏感,40%NF1突变体黑色素细胞系对MEK抑制剂具有高抗性。无携带NF1突变的黑色素瘤细胞系对司美替尼具有不同的敏感性,55%对细胞抑制剂产生抗性(图5-7)。 WB实验中展示在无携带BRAFV600E/K突变体的黑色素细胞中MEK磷酸化水平增高。在非NF1突变体中ERK应激司美替尼而激活,但并不一定与药物抗性相关,这说明pERK的磷酸化不一定需要司美替尼的辅助(图5-8)。 

参考文献:

[1] Gudbjartsson D F, Helgason H, Gudjonsson S A, et al. Large-scale whole-genome sequencing of the Icelandic population.[J]. Nature Genetics, 2015, 47(5):435-44. 

[2] Yuen R K C, Thiruvahindrapuram B, Merico D, et al. Whole-genome sequencing of quartet families with autism spectrum disorder[J]. Nature Medicine, 2015, 21(2):185.

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